临床与环境标本中的军团菌检验方法学

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-5820.2016.01.005

军团菌是引起军团菌病的重要病原体，在世界各地时有暴发流行。我们对军团菌检验方法作了系列实验研究，改进了传统的细菌分离培养和生化试验，建立了聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)酶切分型、巢式PCR、荧光定量PCR、荧光原位杂交、单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms, SNP)分析与基因测序分析等系列军团菌分子生物学检测法。为临床与环境卫生的军团菌检验提供了精准、快速、可靠的病原学诊断依据，对预防和控制军团菌病暴发流行具有重要意义。

关键词: 军团菌, 军团菌病, 临床, 环境卫生, 检验方法学

Legionella spp. is the causative agents of legionellosis. The outbreak of legionellosis was often reported during the past decades around the world. In the present study, a series of experiments were carried out to improve the traditional culture and biochemical method for Legionella. A series of methodologies were also established including the PCR-enzymatic digestion analysis, nested-PCR, real-time fluorescent quantitative PCR, fluorescence in situ hybridization (FISH), single-nucleotide polymorphisms (SNP)-PCR, 16SrRNA and mipgene sequencing, etd. These researches are of great importance and are instructional for accurate, rapid and reliable etiology diagnosis of legionellosis, environmental water monitoring and Legionella epidemiological investigation, finally contribute to legionellosis outbreak control and prevention.

Key words: Legionella, Legionellosis, Clinical, Public health, Methodology

表1 军团菌选择性分离培养基(BCYEα-DGVPC)

成分		含量(g/L)	成分		含量(g/L)
CYE基础(Legionella CYE Base，Oxoid)			DGVPC选择性添加剂(染料抗生素溶液)
?	活性炭(Charcoal activated)	2.0	?	溴甲酚紫(Bromocresol purple)	0.01
?	酵母浸出物(Yeast extract)	10.0	?	溴麝香草酚蓝(Bromothymol blue)	0.01
缓冲和生长添加剂			?	甘氨酸(Glycine)	3.0
?	ACES缓冲剂	10.0	?	万古霉素(Vancomycin)	0.001
?	氢氧化钾(KOH)	2.7	?	多粘菌素B (Polymyxin-B)	80.00^a
?	α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate)	1.0	?	放线菌酮(Cycloheximide)	0.008
?	焦磷酸铁[Fe₄(P₂O₇)₃]	0.25	白蛋白(Albumin)		0.1
?	L-半胱氨酸盐酸盐(L-Cysteine-HCI·H₂O)	0.4	琼脂(Agar)		13.0

表1 军团菌选择性分离培养基(BCYEα-DGVPC)

成分		含量(g/L)	成分		含量(g/L)
CYE基础(Legionella CYE Base，Oxoid)			DGVPC选择性添加剂(染料抗生素溶液)
?	活性炭(Charcoal activated)	2.0	?	溴甲酚紫(Bromocresol purple)	0.01
?	酵母浸出物(Yeast extract)	10.0	?	溴麝香草酚蓝(Bromothymol blue)	0.01
缓冲和生长添加剂			?	甘氨酸(Glycine)	3.0
?	ACES缓冲剂	10.0	?	万古霉素(Vancomycin)	0.001
?	氢氧化钾(KOH)	2.7	?	多粘菌素B (Polymyxin-B)	80.00^a
?	α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate)	1.0	?	放线菌酮(Cycloheximide)	0.008
?	焦磷酸铁[Fe₄(P₂O₇)₃]	0.25	白蛋白(Albumin)		0.1
?	L-半胱氨酸盐酸盐(L-Cysteine-HCI·H₂O)	0.4	琼脂(Agar)		13.0

表2 军团菌运送增菌培养基

成分	含量(g/L)	成分	含量(g/L)
酵母浸出物(Yeast extract)	10.0	甘氨酸(Glycine)	3.0
ACES缓冲剂	10.0	白蛋白(Albumin)	0.1
氢氧化钾(KOH)	2.7	万古霉素(Vancomycin)	0.001
α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate)	1.0	多粘菌素B (Polymyxin-B)	80.00^a
焦磷酸铁[Fe₄(P₂O₇)₃]	0.25	放线菌酮(Cycloheximide)	0.008
L-半胱氨酸盐酸盐(L-Cysteine-HCI·H₂O)	0.5	?	?

表2 军团菌运送增菌培养基

成分	含量(g/L)	成分	含量(g/L)
酵母浸出物(Yeast extract)	10.0	甘氨酸(Glycine)	3.0
ACES缓冲剂	10.0	白蛋白(Albumin)	0.1
氢氧化钾(KOH)	2.7	万古霉素(Vancomycin)	0.001
α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate)	1.0	多粘菌素B (Polymyxin-B)	80.00^a
焦磷酸铁[Fe₄(P₂O₇)₃]	0.25	放线菌酮(Cycloheximide)	0.008
L-半胱氨酸盐酸盐(L-Cysteine-HCI·H₂O)	0.5	?	?

表3 常见军团菌种血清型及其表型特征

军团菌菌种^a	血清型数目	与疾病相关性数目	自发荧光360nm UV	明胶液化	动力	棕色	马尿酸水解	血琼脂上生长	BCYE琼脂生长	半胱氨酸需求	触酶	氧化酶
嗜肺军团菌^b (L. pneumophila)	16	16	－	＋	＋	＋	＋	－	＋	＋	＋	＋/±^g
博兹曼军团菌^c (L.bozemanae)	2	2	兰白荧光	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋/－
杜氏军团菌^d (L. dumoffii)	1	1	兰白荧光	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	－
麦氏军团菌^e (L. micdadei)	1	1	－	－	＋	－	－	－	＋	＋	＋	＋
长滩军团菌(L. longbeachae)	2	2	－	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋
约旦军团菌(L. jordanis)	1	1	－	＋	＋	＋	－	－	＋	－	＋	＋
沃氏军团菌(L. wadsworthii)	1	1	黄绿荧光	＋	＋	－	－	－	＋	＋	＋	－
哈氏军团菌(L. hackeliae)	2	2	－	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋
菲氏军团菌(L. feeleii)	2	2	－	－	＋	＋	＋/－	－	＋	＋	＋	－
马氏军团菌^f (L. maceachernii)	1	1	－	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋

表3 常见军团菌种血清型及其表型特征

军团菌菌种^a	血清型数目	与疾病相关性数目	自发荧光360nm UV	明胶液化	动力	棕色	马尿酸水解	血琼脂上生长	BCYE琼脂生长	半胱氨酸需求	触酶	氧化酶
嗜肺军团菌^b (L. pneumophila)	16	16	－	＋	＋	＋	＋	－	＋	＋	＋	＋/±^g
博兹曼军团菌^c (L.bozemanae)	2	2	兰白荧光	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋/－
杜氏军团菌^d (L. dumoffii)	1	1	兰白荧光	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	－
麦氏军团菌^e (L. micdadei)	1	1	－	－	＋	－	－	－	＋	＋	＋	＋
长滩军团菌(L. longbeachae)	2	2	－	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋
约旦军团菌(L. jordanis)	1	1	－	＋	＋	＋	－	－	＋	－	＋	＋
沃氏军团菌(L. wadsworthii)	1	1	黄绿荧光	＋	＋	－	－	－	＋	＋	＋	－
哈氏军团菌(L. hackeliae)	2	2	－	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋
菲氏军团菌(L. feeleii)	2	2	－	－	＋	＋	＋/－	－	＋	＋	＋	－
马氏军团菌^f (L. maceachernii)	1	1	－	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋

图1 不同军团菌经PCR-HpyCH4III酶切电泳图

图2 不同嗜肺军团菌典型FRET-PCR曲线图

表4 SNP引物序列

序列名称	序列5?-3?	扩增片段(bp)
GL261F	GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC	261^a
GL261R	CGATCTCTACGCATTTCACCG	261^a
LP-A⁶²⁸R	GTCAACCAGTATTATCTGACCGT	203^b
LP-C⁶²⁹F	CTGGGCTTAACCTGGGAC	97^c

表4 SNP引物序列

序列名称	序列5?-3?	扩增片段(bp)
GL261F	GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC	261^a
GL261R	CGATCTCTACGCATTTCACCG	261^a
LP-A⁶²⁸R	GTCAACCAGTATTATCTGACCGT	203^b
LP-C⁶²⁹F	CTGGGCTTAACCTGGGAC	97^c

图3 LEG long探针检测长滩军团菌图

表5 杂交缓冲液和洗脱缓冲液配制

成分	杂交缓冲液(μl)	洗脱缓冲液(ml)
1mol/L Tris-HCl	10	20
探针(probe)	100g^a	-
10% SDS	NA	1
甲酰胺(formamide)	100	NA
dd H₂O	300	925
5 mol/L NaCl	90	45
0.5 mol/L EDTA	-	10
合计	500	1000

表5 杂交缓冲液和洗脱缓冲液配制

成分	杂交缓冲液(μl)	洗脱缓冲液(ml)
1mol/L Tris-HCl	10	20
探针(probe)	100g^a	-
10% SDS	NA	1
甲酰胺(formamide)	100	NA
dd H₂O	300	925
5 mol/L NaCl	90	45
0.5 mol/L EDTA	-	10
合计	500	1000

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The method for Legionella examination in clinical and environment water specimens

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