临床与环境标本中的军团菌检验方法学

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-5820.2016.01.005

军团菌是引起军团菌病的重要病原体，在世界各地时有暴发流行。我们对军团菌检验方法作了系列实验研究，改进了传统的细菌分离培养和生化试验，建立了聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)酶切分型、巢式PCR、荧光定量PCR、荧光原位杂交、单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms, SNP)分析与基因测序分析等系列军团菌分子生物学检测法。为临床与环境卫生的军团菌检验提供了精准、快速、可靠的病原学诊断依据，对预防和控制军团菌病暴发流行具有重要意义。

关键词: 军团菌, 军团菌病, 临床, 环境卫生, 检验方法学

Legionella spp. is the causative agents of legionellosis. The outbreak of legionellosis was often reported during the past decades around the world. In the present study, a series of experiments were carried out to improve the traditional culture and biochemical method for Legionella. A series of methodologies were also established including the PCR-enzymatic digestion analysis, nested-PCR, real-time fluorescent quantitative PCR, fluorescence in situ hybridization (FISH), single-nucleotide polymorphisms (SNP)-PCR, 16SrRNA and mipgene sequencing, etd. These researches are of great importance and are instructional for accurate, rapid and reliable etiology diagnosis of legionellosis, environmental water monitoring and Legionella epidemiological investigation, finally contribute to legionellosis outbreak control and prevention.

Key words: Legionella, Legionellosis, Clinical, Public health, Methodology

表1 军团菌选择性分离培养基(BCYEα-DGVPC)

成分		含量(g/L)	成分		含量(g/L)
CYE基础(Legionella CYE Base，Oxoid)			DGVPC选择性添加剂(染料抗生素溶液)
?	活性炭(Charcoal activated)	2.0	?	溴甲酚紫(Bromocresol purple)	0.01
?	酵母浸出物(Yeast extract)	10.0	?	溴麝香草酚蓝(Bromothymol blue)	0.01
缓冲和生长添加剂			?	甘氨酸(Glycine)	3.0
?	ACES缓冲剂	10.0	?	万古霉素(Vancomycin)	0.001
?	氢氧化钾(KOH)	2.7	?	多粘菌素B (Polymyxin-B)	80.00^a
?	α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate)	1.0	?	放线菌酮(Cycloheximide)	0.008
?	焦磷酸铁[Fe₄(P₂O₇)₃]	0.25	白蛋白(Albumin)		0.1
?	L-半胱氨酸盐酸盐(L-Cysteine-HCI·H₂O)	0.4	琼脂(Agar)		13.0

表1 军团菌选择性分离培养基(BCYEα-DGVPC)

成分		含量(g/L)	成分		含量(g/L)
CYE基础(Legionella CYE Base，Oxoid)			DGVPC选择性添加剂(染料抗生素溶液)
?	活性炭(Charcoal activated)	2.0	?	溴甲酚紫(Bromocresol purple)	0.01
?	酵母浸出物(Yeast extract)	10.0	?	溴麝香草酚蓝(Bromothymol blue)	0.01
缓冲和生长添加剂			?	甘氨酸(Glycine)	3.0
?	ACES缓冲剂	10.0	?	万古霉素(Vancomycin)	0.001
?	氢氧化钾(KOH)	2.7	?	多粘菌素B (Polymyxin-B)	80.00^a
?	α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate)	1.0	?	放线菌酮(Cycloheximide)	0.008
?	焦磷酸铁[Fe₄(P₂O₇)₃]	0.25	白蛋白(Albumin)		0.1
?	L-半胱氨酸盐酸盐(L-Cysteine-HCI·H₂O)	0.4	琼脂(Agar)		13.0

表2 军团菌运送增菌培养基

成分	含量(g/L)	成分	含量(g/L)
酵母浸出物(Yeast extract)	10.0	甘氨酸(Glycine)	3.0
ACES缓冲剂	10.0	白蛋白(Albumin)	0.1
氢氧化钾(KOH)	2.7	万古霉素(Vancomycin)	0.001
α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate)	1.0	多粘菌素B (Polymyxin-B)	80.00^a
焦磷酸铁[Fe₄(P₂O₇)₃]	0.25	放线菌酮(Cycloheximide)	0.008
L-半胱氨酸盐酸盐(L-Cysteine-HCI·H₂O)	0.5	?	?

表2 军团菌运送增菌培养基

成分	含量(g/L)	成分	含量(g/L)
酵母浸出物(Yeast extract)	10.0	甘氨酸(Glycine)	3.0
ACES缓冲剂	10.0	白蛋白(Albumin)	0.1
氢氧化钾(KOH)	2.7	万古霉素(Vancomycin)	0.001
α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate)	1.0	多粘菌素B (Polymyxin-B)	80.00^a
焦磷酸铁[Fe₄(P₂O₇)₃]	0.25	放线菌酮(Cycloheximide)	0.008
L-半胱氨酸盐酸盐(L-Cysteine-HCI·H₂O)	0.5	?	?

表3 常见军团菌种血清型及其表型特征

军团菌菌种^a	血清型数目	与疾病相关性数目	自发荧光360nm UV	明胶液化	动力	棕色	马尿酸水解	血琼脂上生长	BCYE琼脂生长	半胱氨酸需求	触酶	氧化酶
嗜肺军团菌^b (L. pneumophila)	16	16	－	＋	＋	＋	＋	－	＋	＋	＋	＋/±^g
博兹曼军团菌^c (L.bozemanae)	2	2	兰白荧光	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋/－
杜氏军团菌^d (L. dumoffii)	1	1	兰白荧光	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	－
麦氏军团菌^e (L. micdadei)	1	1	－	－	＋	－	－	－	＋	＋	＋	＋
长滩军团菌(L. longbeachae)	2	2	－	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋
约旦军团菌(L. jordanis)	1	1	－	＋	＋	＋	－	－	＋	－	＋	＋
沃氏军团菌(L. wadsworthii)	1	1	黄绿荧光	＋	＋	－	－	－	＋	＋	＋	－
哈氏军团菌(L. hackeliae)	2	2	－	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋
菲氏军团菌(L. feeleii)	2	2	－	－	＋	＋	＋/－	－	＋	＋	＋	－
马氏军团菌^f (L. maceachernii)	1	1	－	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋

表3 常见军团菌种血清型及其表型特征

军团菌菌种^a	血清型数目	与疾病相关性数目	自发荧光360nm UV	明胶液化	动力	棕色	马尿酸水解	血琼脂上生长	BCYE琼脂生长	半胱氨酸需求	触酶	氧化酶
嗜肺军团菌^b (L. pneumophila)	16	16	－	＋	＋	＋	＋	－	＋	＋	＋	＋/±^g
博兹曼军团菌^c (L.bozemanae)	2	2	兰白荧光	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋/－
杜氏军团菌^d (L. dumoffii)	1	1	兰白荧光	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	－
麦氏军团菌^e (L. micdadei)	1	1	－	－	＋	－	－	－	＋	＋	＋	＋
长滩军团菌(L. longbeachae)	2	2	－	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋
约旦军团菌(L. jordanis)	1	1	－	＋	＋	＋	－	－	＋	－	＋	＋
沃氏军团菌(L. wadsworthii)	1	1	黄绿荧光	＋	＋	－	－	－	＋	＋	＋	－
哈氏军团菌(L. hackeliae)	2	2	－	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋
菲氏军团菌(L. feeleii)	2	2	－	－	＋	＋	＋/－	－	＋	＋	＋	－
马氏军团菌^f (L. maceachernii)	1	1	－	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋	＋

图1 不同军团菌经PCR-HpyCH4III酶切电泳图

图2 不同嗜肺军团菌典型FRET-PCR曲线图

表4 SNP引物序列

序列名称	序列5?-3?	扩增片段(bp)
GL261F	GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC	261^a
GL261R	CGATCTCTACGCATTTCACCG	261^a
LP-A⁶²⁸R	GTCAACCAGTATTATCTGACCGT	203^b
LP-C⁶²⁹F	CTGGGCTTAACCTGGGAC	97^c

表4 SNP引物序列

序列名称	序列5?-3?	扩增片段(bp)
GL261F	GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC	261^a
GL261R	CGATCTCTACGCATTTCACCG	261^a
LP-A⁶²⁸R	GTCAACCAGTATTATCTGACCGT	203^b
LP-C⁶²⁹F	CTGGGCTTAACCTGGGAC	97^c

图3 LEG long探针检测长滩军团菌图

表5 杂交缓冲液和洗脱缓冲液配制

成分	杂交缓冲液(μl)	洗脱缓冲液(ml)
1mol/L Tris-HCl	10	20
探针(probe)	100g^a	-
10% SDS	NA	1
甲酰胺(formamide)	100	NA
dd H₂O	300	925
5 mol/L NaCl	90	45
0.5 mol/L EDTA	-	10
合计	500	1000

表5 杂交缓冲液和洗脱缓冲液配制

成分	杂交缓冲液(μl)	洗脱缓冲液(ml)
1mol/L Tris-HCl	10	20
探针(probe)	100g^a	-
10% SDS	NA	1
甲酰胺(formamide)	100	NA
dd H₂O	300	925
5 mol/L NaCl	90	45
0.5 mol/L EDTA	-	10
合计	500	1000

1	Fraser DW, Tsai TR, Orenstein W, et al. Legionnairesʹ Disease：Description of an Epidemic of Pneumonia [J]. N Engl J Med, 1977, 297(22): 1189-1197.
2	Fields BS, Benson RF, Besser RE. Legionella and Legionnairesʹ Disease: 25 Years of Investigation [J]. Clin Microbiol Rev, 2002, 15(3): 506-526.
3	Euzéby J.P. List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature-Genus Legionella. 2015, URL
4	Diederen BM. Legionella spp. and Legionnairesʹ disease [J]. J Infec, 2008, 56(1): 1-12.
5	Glick TH, Gregg MB, Berman B, et al. An epidemic of unknown etiology in a health department:I.Clinical and epidemiologic aspects [J]. Am J Epidemiol, 1978, 107(2): 149-160.
6	Yu VL, Plouffe JF, Pastoris MC, et al. Distribution of Legionella Species and Serogroups Isolated by Culture in Patients with Sporadic Community-Acquired Legionellosis: An International Collaborative Survey [J]. J Infec Dis, 2002, 186: 127-128.
7	Newton HJ, Ang DKY, van Driel IR, et al. Molecular Pathogenesis of Infections Caused by Legionell apneumophila [J]. Clin Microbiol Rev, 2010, 23: 274-298.
8	Zhan XY, Li LQ, Hu CH, et al. Two-Step Scheme for Rapid Identification and Differentiation of Legionella pneumophila and Non-Legionella pneumophila Species [J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(2): 433-439.
9	朱庆义，胡朝晖，梁耀铭，等. 嗜肺军团菌培养毒力岛聚合酶链反应分型鉴定 [J]. 中华检验医学杂志, 2006, 29(7): 647-650.
10	胡朝晖，屈平华，朱庆义. 广东地区嗜肺军团菌的扩增片段长度多态性分析 [J]. 微生物学报, 2008, 42(12): 1659-1665.
11	赵利伟，胡朝晖，朱庆义. 聚合酶链反应-酶切分型鉴定广州地区环境水源军团菌 [J]. 微生物学报, 2010, 50(11): 1532-1536.
12	Zhan XY, Hu CH, Zhu QY. Targeting single-nucleotide polymorphisms in the 16S rRNAgene to detect and differentiate Legionella pneumophila and non-Legionella pneumophila species [J]. Arch Microbiol, 2016,198(6): 591-594.
13	胡朝晖，朱庆义，刘本荣，等. 军团菌选择性分离培养基及其实用性研究 [J]. 国际检验医学杂志, 2006, 27(3): 209-211, 214.
14	朱庆义，宋亚军，邵祝军, 等. 军团菌和军团菌病 [M], 北京科学出版社, 2014.
15	朱庆义，胡朝晖，梁耀铭，等. 广东地区环境水源还临床标本嗜肺军团菌培养与基因快速鉴定 [J]. 中华医院感染学杂志, 2006, 16(1): 19-22.
16	赵利伟，胡朝晖，朱庆义, 等. PCR-酶切技术快速鉴定军团菌 [J]. 微生物学通报, 2013, 8: 1514-1520.
17	Zhao LW, Xuan RH, Zhu QY, et al. Use of a new seminested PCR combined with enzymatic digestion analysis for detection and differentiation of Legionella species and Legionella pneumophila in environmental water and sputum samples [J]. AJMR, 2012, 6(10): 2522-2527.
18	Diederen BMW, de Jong CMA, Marmouk F, et al. Evaluation of real-time PCR for the early detection of Legionella pneumophila DNA in serum samples [J]. J Med Microbiol, 2007, 56(1): 94-101.
19	黄宪章，周华友，朱庆义, 等. 实时荧光定量PCR检测痰标本中军团菌属 [J]. 中华医院感染学杂志, 2011, 21(4): 831-834.
20	Reischl U, Linde HJ, Lehn N, et al. Direct Detection and Differentiation of Legionella spp. and Legionella pneumophila in Clinical Specimens by Dual-Color Real-Time PCR and Melting Curve Analysis [J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(10): 3814- 3817.
21	戈立秀，赵利伟，朱庆义, 等. 实时荧光PCR熔解曲线法快速鉴定嗜肺军团菌 [J]. 临床检验杂志, 2012, 30(3): 187-189.
22	顾全，赵利伟，朱庆义. 荧光原位杂交技术在军团菌研究中的应用与进展[J]. 中国卫生检验杂志, 2013, 07: 1828-1830.
23	Whiley H, Bentham R. Legionella longbeachae and Legionellosis [J]. Emerg Infect Dis, 2011, 17(4): 579-584.
24	Ratcliff RM, Lanser JA, Manning PA, et al. Sequence-Based classification scheme for the genus Legionella targeting the mip gene [J]. J Clin Microbiol, 1998, 36(6): 1560-1567.
25	Wilson DA, Reischl U, Hall GS,et al. Use of partial 16S rRNA gene sequencing for identification of Legionella pneumophila and non-pneumophila Legionella spp [J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(1): 257-258.

[1]	贺敬龙, 尚宏喜, 郝敏, 谢伟, 高明宏, 孙炜, 刘安庆. 重度类风湿关节炎患者行多关节置换术的临床手术疗效[J]. 中华关节外科杂志(电子版), 2023, 17(06): 860-864.
[2]	张华, 孙宇, 乡世健, 李樱媚, 王小群. 循环肿瘤细胞预测晚期胃肠癌患者化疗药物敏感性的研究[J]. 中华普通外科学文献(电子版), 2023, 17(06): 422-425.
[3]	董杰, 杨松, 杨浩, 陈翔, 张万里. 乙酰辅酶A羧化酶2基因高甲基化与肝细胞癌临床病理因素和生存期的关系[J]. 中华普通外科学文献(电子版), 2023, 17(06): 433-437.
[4]	姚宏伟, 魏鹏宇, 高加勒, 张忠涛. 不断提高腹腔镜右半结肠癌D3根治术的规范化[J]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2024, 18(01): 1-4.
[5]	栗艳松, 冯会敏, 刘明超, 刘泽鹏, 姜秋霞. STIP1在三阴性乳腺癌组织中的表达及临床意义研究[J]. 中华普外科手术学杂志(电子版), 2024, 18(01): 52-56.
[6]	胡建生, 周佐霖, 孙林梅, 马腾辉. 不同诊断分型的慢性放射性直肠损伤临床治疗转归：85例回顾性分析[J]. 中华结直肠疾病电子杂志, 2023, 12(06): 466-472.
[7]	邹敏, 徐明, 吴伟强, 归明彬, 高峰. 低位直肠癌新辅助放化疗应用的焦点问题[J]. 中华结直肠疾病电子杂志, 2023, 12(05): 363-371.
[8]	任加发, 邬步云, 邢昌赢, 毛慧娟. 2022年急性肾损伤领域基础与临床研究进展[J]. 中华肾病研究电子杂志, 2023, 12(05): 276-281.
[9]	梁文龙, 曹杰, 黄庆, 林泳, 黄红丽, 杨平, 李冠炜, 胡鹤. 信迪利单抗联合瑞戈非尼治疗晚期结直肠癌的疗效与安全性分析[J]. 中华消化病与影像杂志(电子版), 2023, 13(06): 409-413.
[10]	姜里蛟, 张峰, 周玉萍. 多学科诊疗模式救治老年急性非静脉曲张性上消化道大出血患者的临床观察[J]. 中华消化病与影像杂志(电子版), 2023, 13(06): 520-524.
[11]	徐军, 姬园园, 陈君平, 王健. 伴菊形团结构的脑膜瘤合并颅骨侵犯一例并文献复习[J]. 中华临床医师杂志(电子版), 2023, 17(08): 916-919.
[12]	李瑞琦, 吴子健, 吴杰斌, 任佳佳, 翟敬芳. 动脉血气分析判读Excel电子表格在实习生酸碱平衡紊乱教学中的应用[J]. 中华临床医师杂志(电子版), 2023, 17(06): 737-743.
[13]	李莹倩, 李华山. 基于真实世界的完全性直肠脱垂治疗方式评价[J]. 中华临床医师杂志(电子版), 2023, 17(06): 700-705.
[14]	丁倩, 王谦, 郭春彦, 张怡, 梁宇光. 基于SWOT分析法探讨儿科临床药师在药物临床研究中的作用[J]. 中华临床医师杂志(电子版), 2023, 17(05): 581-586.
[15]	朱敏, 李法强. 血清GFAP、UCH-L1联合VILIP-1水平对急性脑梗死神经功能预后不良的预测研究[J]. 中华脑血管病杂志(电子版), 2023, 17(05): 452-457.

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The method for Legionella examination in clinical and environment water specimens

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