加减知柏地黄丸对特发性中枢性性早熟小鼠骨细胞骨形成蛋白-Smads信号通路的影响

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-5820.2023.04.004

目的

探讨加减知柏地黄丸对特发性中枢性性早熟（ICPP）小鼠骨细胞骨形成蛋白（BMP）-Smads信号通路的影响。

方法

将36只SPF级雌性C57小鼠随机分为6组：正常对照组、ICPP模型组、知柏地黄丸高剂量组、知柏地黄丸低剂量组、甲地孕酮阳性对照组、促性腺激素释放激素类似物（GnRH-A）组，每组6只；正常对照组给予生理盐水腹腔注射，同时给予蒸馏水灌胃，上午给药，每天1次，连续7 d。ICPP模型组和用药组把腹腔注射更换为瘦素，注射药量为2 mg/kg，ICPP模型组用蒸馏水灌胃，知柏地黄丸高剂量组、知柏地黄丸低剂量组、甲地孕酮阳性对照组用对应的药物灌胃，连续7 d，每天1次；GnRH-A组不灌胃而是以抑那通于右后肢处肌肉注射，隔日1次，共3次。所有组别于小鼠日龄26 d时结束实验。取下腔静脉血，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中促卵泡素（FSH）、促黄体激素（LH）、N端中段骨钙素（N-MID）、碱性磷酸酶（ALP）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）；取右侧股骨免疫印迹检测BMP-2、Smad1、Smad5、Smad8与Smad4表达量。

结果

与正常对照组比较，ICPP模型组血清中FSH、LH、N-MID、ALP、IGF-1含量明显升高（P<0.05），BMP-2、Smad1、Smad5、Smad8与Smad4表达量明显上调（P<0.05）。与ICPP模型组比较，知柏地黄丸高剂量组、知柏地黄丸低剂量组、甲地孕酮阳性对照组中FSH、LH、N-MID、ALP、IGF-1含量明显降低（P<0.05），BMP-2、Smad1、Smad5、Smad8 与 Smad4表达量明显降低（P<0.05），知柏地黄丸高剂量组比低剂量组下调明显。与ICPP模型组比较，GnRH-A组FSH、LH含量偏高（P<0.05），ALP含量偏低（P<0.05），N-MID、IGF-1差异无统计学意义，BMP-2、Smad1、Smad5 与 Smad4表达量差异有统计学意义（P<0.05），Smad8差异无统计学意义。

结论

ICPP小鼠骨细胞BMP-Smads信号通路表达增强，加减知柏地黄丸可以下调BMP-Smads信号通路的表达水平，且与知柏地黄丸具有剂量相关性。

关键词: 加减知柏地黄丸, 特发性中枢性性早熟, 骨形成蛋白, Smads, 信号通路

Objective

To investigate the effect of modified Zhibai Dihuang pill on the bone morphogenetic protein (BMP)-Smads signaling pathway in bone cells from idiopathic central precocious puberty (ICPP) mice.

Methods

36 SPF-grade female C57 mice were randomly divided into six groups: normal control group, ICPP model group, high-dose Zhibai Dihuang pill group, low-dose Zhibai Dihuang pill group, megestrol acetate positive control group, and gonadotropin releasing hormone analogue (GnRH-A) group. The normal control group was administered with physiological saline by intraperitoneal injection and distilled water was administered by gavage in the morning, once a day for 7 consecutive days. The ICPP model group and the drug group were administered with leptin by intraperitoneal injection at a dose of 2 mg/kg. The Zhibai Dihuang pill groups, the medroxyprogesterone acetate positive control group, and the GnRH-A group were administered with the corresponding drugs by gavage, also once a day for 7 days. The GnRH-A group received intramuscular injection of Yinatong at the right hind limb without gavage, once every other day, for a total of three times. The experiment was ended at 26 days. Serum follicle-stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH), N-mid osteocalcin (N-MID), alkaline phosphatase (ALP), and insulin-like growth factor-1 (IGF-1) were measured using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in inferior vena cava blood. Western blot was detected the expression of BMP-2, Smad1, Smad5, Smad8, and Smad4 in the right femur.

Results

Compared with the normal control group, the serum levels of FSH, LH, N-MID, ALP, and IGF-1 in the ICPP model group were significantly increased (P<0.05), and the expression levels of BMP-2, Smad1, Smad5, Smad8, and Smad4 were significantly increased (P<0.05); Compared with the ICPP model group, the levels of FSH, LH, N-MID, ALP, and IGF-1 in the high-dose group of Zhibai Dihuang pill, the low-dose group of Zhibai Dihuang pill, and the megestrol positive control group were significantly decreased (P<0.05), the expression of BMP-2, Smad1, Smad5, Smad8 and Smad4 were significantly decreased (P<0.05), Zhibai Dihuang pill high dose group was significantly down-regulated than low dose group. Compared with ICPP model group, the contents of FSH and LH in GnRH-A group were higher (P<0.05) and low ALP content (P<0.05), N-MID and IGF-1 were not significantly different, while BMP-2, Smad1, Smad5 and Smad4 were significantly different (P<0.05) and Smad8 showed no significant difference.

Conclusions

The expression of BMP-Smads signal pathway in bone cells of ICPP mice was enhanced, and the expression level of BMP-Smads signaling pathway could be down-regulated by addition or reduction of Zhibai Dihuang pill, which was dose-dependent with Zhibai Dihuang pill.

Key words: modified Zhibai Dihuang pill, idiopathic central precocious puberty, bone morphogenetic protein, Smads, signal path

表1 实验仪器和型号

仪器名称	仪器来源	型号
电泳仪	美国BIO-RAD 公司	mini protean 3 cell
电转仪	美国Hoefer公司	TE77XP
酶标仪	美国Thermo公司	酶标仪MK3
移液器	法国吉尔森公司	P型移液器
水浴锅	德国Leica公司	HI1210水浴锅
成像系统	上海Tanon公司	Tanon-5200

表1 实验仪器和型号

仪器名称	仪器来源	型号
电泳仪	美国BIO-RAD 公司	mini protean 3 cell
电转仪	美国Hoefer公司	TE77XP
酶标仪	美国Thermo公司	酶标仪MK3
移液器	法国吉尔森公司	P型移液器
水浴锅	德国Leica公司	HI1210水浴锅
成像系统	上海Tanon公司	Tanon-5200

图1 各组血清FSH、LH、N-MID、ALP、IGF-1含量的比较注：1A.FSH标准曲线；1B.LH标准曲线；1C.N-MID标准曲线；1D. ALP标准曲线；1E. IGF-1标准曲线。

表2 各组小鼠血清中FSH、LH、N-MID、ALP、IGF-1含量的比较（，n=6）

组别	FSH/（IU/L）	LH/（ng/L）	N-MID/（μg/L）	ALP/（ng/ml）	IGF-1/（μg/L）
正常对照组	3.81±0.39	13.27±0.55	20.86±0.65	19.73±1.26	6.99±0.58
ICPP模型组	6.64±0.21^a	23.80±2.07^a	43.32±1.08^a	43.09±0.81^a	12.08±0.30^a
知柏地黄丸高剂量组	4.54±0.15^b	17.09±0.83^b	28.68±3.55^b	27.14±1.74^b	8.78±0.85^b
知柏地黄丸低剂量组	6.24±0.13^b	19.46±0.65^b	38.30±3.44^b	34.56±2.47^b	10.33±0.60^b
甲地孕酮阳性对照组	5.66±0.30^b	17.02±1.77^b	33.14±3.45^b	30.54±1.49^b	9.02±0.25^b
GnRH-A组	6.97±0.11^b	25.32±0.89^b	46.01±1.04	40.59±1.46^b	12.70±0.30

表2 各组小鼠血清中FSH、LH、N-MID、ALP、IGF-1含量的比较（，n=6）

组别	FSH/（IU/L）	LH/（ng/L）	N-MID/（μg/L）	ALP/（ng/ml）	IGF-1/（μg/L）
正常对照组	3.81±0.39	13.27±0.55	20.86±0.65	19.73±1.26	6.99±0.58
ICPP模型组	6.64±0.21^a	23.80±2.07^a	43.32±1.08^a	43.09±0.81^a	12.08±0.30^a
知柏地黄丸高剂量组	4.54±0.15^b	17.09±0.83^b	28.68±3.55^b	27.14±1.74^b	8.78±0.85^b
知柏地黄丸低剂量组	6.24±0.13^b	19.46±0.65^b	38.30±3.44^b	34.56±2.47^b	10.33±0.60^b
甲地孕酮阳性对照组	5.66±0.30^b	17.02±1.77^b	33.14±3.45^b	30.54±1.49^b	9.02±0.25^b
GnRH-A组	6.97±0.11^b	25.32±0.89^b	46.01±1.04	40.59±1.46^b	12.70±0.30

图2 BMP-2、Smad1、Smad5、Smad8与Smad4各组蛋白表达水平

表3 各组小鼠骨组织中BMP-2、Smad1、Smad5、Smad8与Smad4校正灰度值的比较（，n=6）

组别	BMP-2	Smad1	Smad5	Smad8	Smad4
正常对照组	0.48±0.02	0.45±0.02	0.44±0.02	0.11±0.02	0.63±0.01
ICPP模型组	1.00±0.01^a	0.98±0.02^a	0.93±0.03^a	0.52±0.01^a	1.08±0.01^a
知柏地黄丸高剂量组	0.44±0.01^b	0.48±0.02^b	0.47±0.01^b	0.30±0.03^b	0.67±0.01^b
知柏地黄丸低剂量组	0.62±0.01^b	0.62±0.02^b	0.65±0.02^b	0.48±0.02^b	0.92±0.01^b
甲地孕酮阳性对照组	0.41±0.03^b	0.72±0.02^b	0.50±0.03^b	0.31±0.02^b	0.80±0.02^b
GnRH-A组	0.50±0.03^b	0.70±0.01^b	0.66±0.03^b	0.54±0.01	1.04±0.02^b

表3 各组小鼠骨组织中BMP-2、Smad1、Smad5、Smad8与Smad4校正灰度值的比较（，n=6）

组别	BMP-2	Smad1	Smad5	Smad8	Smad4
正常对照组	0.48±0.02	0.45±0.02	0.44±0.02	0.11±0.02	0.63±0.01
ICPP模型组	1.00±0.01^a	0.98±0.02^a	0.93±0.03^a	0.52±0.01^a	1.08±0.01^a
知柏地黄丸高剂量组	0.44±0.01^b	0.48±0.02^b	0.47±0.01^b	0.30±0.03^b	0.67±0.01^b
知柏地黄丸低剂量组	0.62±0.01^b	0.62±0.02^b	0.65±0.02^b	0.48±0.02^b	0.92±0.01^b
甲地孕酮阳性对照组	0.41±0.03^b	0.72±0.02^b	0.50±0.03^b	0.31±0.02^b	0.80±0.02^b
GnRH-A组	0.50±0.03^b	0.70±0.01^b	0.66±0.03^b	0.54±0.01	1.04±0.02^b

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Study on the effect of modified Zhibai Dihuang pill on bone cells in idiopathic central precocious puberty mice based on BMP-Smads signaling pathway

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