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  • 基于RAA-CRISPR-Cas12a检测肺炎克雷伯菌KPC型碳青霉烯酶基因方法的建立及评价
    胡春财, 袁伟曦, 赖少芬, 魏楚洪, 余高平, 肖文玲, 尹小毛
    中华临床实验室管理电子杂志 . 2025, 13 (03): 166-171.
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    目的

    建立一种基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)-规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas12a)快速检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)型碳青霉烯酶(blaKPC)基因的分子检测技术。

    方法

    根据blaKPC基因序列设计特异性RAA引物和CRISPR RNA(crRNA),构建基于RAA-CRISPR-Cas12a检测blaKPC基因的方法。收集2022至2023年佛山市顺德区乐从医院保存的4株携带blaKPC基因的肺炎克雷伯菌用于方法研究,40株肺炎克雷伯菌临床菌株用于方法评价,同时采用实时荧光定量PCR(qPCR)进行检测,比较两种方法的检出率和一致性。

    结果

    本研究建立的用以检测blaKPC基因的RAA-CRISPR-Cas12a方法的灵敏度可达到10拷贝/µl。同时采用RAA-CRISPR-Cas12a和qPCR方法检测40株肺炎克雷伯菌临床菌株,两种方法同时检出5株携带blaKPC基因,35株未携带blaKPC基因,以qPCR方法为金标准,本研究建立的方法敏感度为100%(5/5),灵敏度为100%(35/35),两种方法的符合率100%。

    结论

    建立的RAA-CRISPR-Cas12a方法为精准检测blaKPC基因提供了又一种技术手段,有助于临床快速筛选携带blaKPC基因的菌株。

图1 不同RAA引物在RAA-CRISPR-Cas12a方法中的检测
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