流感病毒即时检验研究进展

doi:10.3877/cma.j.issn.2095-5820.2022.01.008

流行性感冒是由流感病毒引起的一种传播快、传染力强的人类呼吸道传染病，可在全球范围造成巨大的生命和财产损失。世界卫生组织已将开发针对呼吸道病毒的即时检验（POCT）列为优先事项。POCT对流感样患者进行快速、准确的诊断，对预防和控制流感病毒的传播以及减少重症病人的发生发展有重要意义。基于免疫学的流感病毒POCT快速、简便但灵敏度低，基于检测核酸的流感POCT方便快捷，弥补了免疫学POCT灵敏度低的缺点，未来通过优化成本效益可在临床POCT环境中大量应用。现对目前用于诊断流感病毒的正在应用和开发研究的POCT方法进行综述。

关键词: 流感病毒, 即时检验

Influenza is a rapidly spreading and highly infectious human respiratory infectious disease caused by influenza viruses, which can cause huge loss of life and property on a global scale. The World Health Organization has prioritized the development of point-of-care testing (POCT) for respiratory viruses. The rapid and accurate diagnosis of influenza-like patients by POCT is of great significance for preventing and controlling the spread of influenza virus and reducing the occurrence and development of severely ill patients. Influenza POCT based on immunology is fast, simple but low sensitivity. Influenza POCT based on nucleic acid detection is convenient and quick, which makes up for the shortcomings of low sensitivity of immunology POCT. In the future, through optimization of cost-effectiveness, it can be applied in a large number of clinical immediate testing environments. This article summarizes the POCT methods that are currently being applied and developing diagnosis of influenza viruses.

Key words: Influenza virus, Point-of-care testing

表1 流感病毒传统实验室检测方法^［3］

项目	方法
血清学检测	(1) 血凝抑制(hemagglutina-tion inhibition)； (2) 病毒中和(virus neutralization)； (3) 单向辐射状溶血实验(single radial hemolysis，SRH)； (4) 补体结合(complement fixation)； (5) 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)； (6) 蛋白质印迹法(western blot)；
测序	(1) Sanger method； (2) Illumina； (3) Platform； (4) Roche 454 Life Sciences； (5) Ion Proton； (6) SOLid； (7) Pacific Bioscience； (8) Oxford Nanopore； (9) Complete Genomics；
病毒培养	(1) 免疫荧光显微镜(immunofluores-cence microscopy)； (2) 抗体染色(antibody staining)； (3) 红细胞吸附试验(erythrocytes hemadsorption)；
核酸检测	(1) 逆转录PCR； (2) 连接酶链反应(ligase chain reaction)； (3) DNA微阵列技术 (DNA microarray tests)； (4) 简单扩增技术(SAMBA)； (5) 核酸序列依赖扩增技术(NASBA)； (6) 环介导等温扩增技术(LAMP)；
抗原检测	(1) 直接荧光抗体染色； (2) 间接荧光抗体染色；

表1 流感病毒传统实验室检测方法^［3］

项目	方法
血清学检测	(1) 血凝抑制(hemagglutina-tion inhibition)； (2) 病毒中和(virus neutralization)； (3) 单向辐射状溶血实验(single radial hemolysis，SRH)； (4) 补体结合(complement fixation)； (5) 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)； (6) 蛋白质印迹法(western blot)；
测序	(1) Sanger method； (2) Illumina； (3) Platform； (4) Roche 454 Life Sciences； (5) Ion Proton； (6) SOLid； (7) Pacific Bioscience； (8) Oxford Nanopore； (9) Complete Genomics；
病毒培养	(1) 免疫荧光显微镜(immunofluores-cence microscopy)； (2) 抗体染色(antibody staining)； (3) 红细胞吸附试验(erythrocytes hemadsorption)；
核酸检测	(1) 逆转录PCR； (2) 连接酶链反应(ligase chain reaction)； (3) DNA微阵列技术 (DNA microarray tests)； (4) 简单扩增技术(SAMBA)； (5) 核酸序列依赖扩增技术(NASBA)； (6) 环介导等温扩增技术(LAMP)；
抗原检测	(1) 直接荧光抗体染色； (2) 间接荧光抗体染色；

图1 POCT场所^［6］

表2 商业POCT检测方法比较

项目	难度	机器	检测对象	检测样品
免疫胶体金法	简单	不需额外机器	抗原、抗体	洗鼻、洗鼻液、鼻拭子、鼻咽拭子（Alere BinaxNOW^®Influenza A & B Card）^［8］
免疫荧光法	简单	荧光检测器	抗原	鼻拭子、鼻咽拭子、洗鼻、鼻咽冲洗^［8］（Sofia Influenza A + B FIA）
Dot-ELISA	操作略复杂^［9］	不需额外仪器	抗原	咽拭子、鼻拭子、含漱液^［9］
PCR	简单	需专用仪器	核酸	鼻拭子^［10］
PCR	简单	需要专用仪器	核酸	鼻咽拭子、洗鼻液、洗鼻^［8］
PCR	简单	需专用仪器	核酸	鼻咽拭子^［8］
PCR	简单	需专用仪器	核酸	鼻咽拭子^［8］
LAMP	简单	需要专用仪器	核酸	鼻拭子、鼻咽拭子、病毒传输介质^{［8, 11］}

表2 商业POCT检测方法比较

项目	难度	机器	检测对象	检测样品
免疫胶体金法	简单	不需额外机器	抗原、抗体	洗鼻、洗鼻液、鼻拭子、鼻咽拭子（Alere BinaxNOW^®Influenza A & B Card）^［8］
免疫荧光法	简单	荧光检测器	抗原	鼻拭子、鼻咽拭子、洗鼻、鼻咽冲洗^［8］（Sofia Influenza A + B FIA）
Dot-ELISA	操作略复杂^［9］	不需额外仪器	抗原	咽拭子、鼻拭子、含漱液^［9］
PCR	简单	需专用仪器	核酸	鼻拭子^［10］
PCR	简单	需要专用仪器	核酸	鼻咽拭子、洗鼻液、洗鼻^［8］
PCR	简单	需专用仪器	核酸	鼻咽拭子^［8］
PCR	简单	需专用仪器	核酸	鼻咽拭子^［8］
LAMP	简单	需要专用仪器	核酸	鼻拭子、鼻咽拭子、病毒传输介质^{［8, 11］}

图2 中国国家药品监督管理总局2021年1月31日官网批准上市的流感病毒POCT堆积柱状图^［12］

图3 美国食品药品监督管理局2021年2月4日官网批准上市的流感病毒POCT堆积柱状图^［17］

表3 正在发展的POCT技术

技术	原理	操作	机器	检测对象	检测样品
CCPCR	在毛细管式芯片的垂直方向上施加稳态的温度梯度环境，在温度差和重力差的作用下DNA分子在温度梯度环境中不断循环和扩增。	复杂，需手动提取核酸	便携式小型化仪器TD-01（长18 cm、宽18 cm、高12 cm）	核酸	咽喉拭子、鼻咽拭子^［24］
生物传感器	检测能够选择性地与固定在传感器上的特定生物分子（“探针”或“捕获分子”）相互作用的特定物质。			核酸、抗原	鼻咽拭子、鼻拭子、鼻咽冲洗、鼻腔冲洗^［25］
生物芯片	通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将不连续的分析过程集成固相载体以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、高通量的检测。	简单		核酸、抗原	鼻拭子^［26］
RT-SIBA	一种等温扩增技术。逆转录产生cDNA，通过重组酶将单链侵袭寡核苷酸（invasion oligonucleotide，IO）插入到目标双链DNA的互补区，解离目标DNA产生单链DNA，在DNA聚合酶的作用下结合和延伸靶序列。	简单	不需复杂仪器	核酸	鼻咽拭子、鼻咽抽吸物^［27］

表3 正在发展的POCT技术

技术	原理	操作	机器	检测对象	检测样品
CCPCR	在毛细管式芯片的垂直方向上施加稳态的温度梯度环境，在温度差和重力差的作用下DNA分子在温度梯度环境中不断循环和扩增。	复杂，需手动提取核酸	便携式小型化仪器TD-01（长18 cm、宽18 cm、高12 cm）	核酸	咽喉拭子、鼻咽拭子^［24］
生物传感器	检测能够选择性地与固定在传感器上的特定生物分子（“探针”或“捕获分子”）相互作用的特定物质。			核酸、抗原	鼻咽拭子、鼻拭子、鼻咽冲洗、鼻腔冲洗^［25］
生物芯片	通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将不连续的分析过程集成固相载体以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、高通量的检测。	简单		核酸、抗原	鼻拭子^［26］
RT-SIBA	一种等温扩增技术。逆转录产生cDNA，通过重组酶将单链侵袭寡核苷酸（invasion oligonucleotide，IO）插入到目标双链DNA的互补区，解离目标DNA产生单链DNA，在DNA聚合酶的作用下结合和延伸靶序列。	简单	不需复杂仪器	核酸	鼻咽拭子、鼻咽抽吸物^［27］

表4 发展中的流感POCT生物芯片技术

项目	原理	特点	作者
生物传感器技术	靶DNA通过PCR产生标记有生物素的核酸产物，在传感器中PCR产物与特异性探针结合，该探针被磁珠上共价结合的特异性寡核苷酸捕获，通过链霉亲和素-碱性磷酸酶与PCR产物相结合，碱性磷酸酶可切割底物的磷酸基团产生电流信号，电化学传感器通过检测电流信号对PCR产物进行定量。但该设备缺乏RNA逆转录功能。	检测速度快（16 min），但只能检测DNA	J. A. MacLeod^［34］
生物芯片技术	基于RT-PCR的微流控芯片	以检测多呼吸道病毒，但缺乏自动提取核酸的功能	Hardick^［35］
生物芯片技术	为将逆转录引物共价固定在聚乙二醇水凝胶颗粒表面，并将封闭了PCR引物在内的低熔点琼脂糖凝胶胶囊（low melti-ng point agarose，LMPA）引入至上述颗粒中，在逆转录过程中水凝胶颗粒上的逆转录引物与靶RNA进行逆转录反应，由于逆转录反应温度低于LMPA的熔点不会使PCR引物释放出来，当温度上升至PCR反应温度时PCR引物可从熔融的LMPA中释放并以游离形式参与PCR反应。	大量减少了传统RT-PCR反应时逆转录引物、PCR引物和靶RNA在逆转录时可能产生的非特异性产物。该技术还可以通过使用单色荧光光学系统在30 min内有效的进行18种一步qRT-PCR	Junsun Kim^［36］
生物芯片技术	基于芯片的一步法多重RT-PCR技术，并根据荧光信号判断结果	在23 min内完成反应，但缺乏自动提取核酸的功能	Soon-Hwan Kwon^［37］
生物芯片技术	利用磁性和标记有不同血凝素抗体的体积大小不同的磁珠在磁场中分离流感病毒血凝素，在微流控芯片上建立了可同时检测和分离多重流感血凝素（HA）的免疫自动检测方法	特异性高、抗干扰能力强、重复性好。H7N9 HA的检出浓度低至3.4 ng/ml，H9N2 HA的检出浓度为4.5 ng/ml	Shuibing Wang^［38］
生物芯片技术	利用双适配子设计了一个完整的磁珠微流控系统，样品中存在甲型流感病毒时，可在芯片上形成适配子-H1N1病毒-适配子结合复合物，并通过荧光信号表达	检测时间短（30 min），无需人工干预，检测成本低，灵敏度是常规血清学诊断的10³倍	Yi-Ting Tseng^［39］
生物芯片技术	一种基于芯片的检测系统，名为iROAD，该系统使用基于逆转录的RPA技术，以无标记和实时的方式同时进行病毒RNA的扩增和检测	检测限是实时逆转录-PCR方法的10倍，可用于快速分析（＜20 min），但缺乏自动提取核酸的功能	Bonhan Koo^［40］
生物芯片技术	多重呼吸道病毒检测的LAMP集成微流控芯片系统（LAMP-integrated microfluidic chip system formultiplexed respiratory virus assays，LMCS-MRVA），该系统包括用于核酸提取的磁珠、与LAMP技术结合的八通道微流控阵列芯片，以及实时对结果颜色的变化进行比色分析	该检测系统通过制作相对独立、完全密封的反应室，避免了LAMP反应时的气溶胶污染、试剂蒸发和交叉污染。该系统对咽拭子标本中2~4 fg/μl的检出限在1 h内即可完成，特异性（100%）和灵敏度（96%）高	Wang R^［19］
生物芯片技术	一种使用等温扩增（LAMP）方法的微流控设备。	该系统速度快（＜40 min），体积小（19.3×16.5×12.3 cm³），由锂（Li）离子电池供电，可通过智能手机上的软件控制反应时间、温度，实时监控LAMP反应状态并观察检测结果，可由非专业人员操作且可定性和定量检测病原体。检测甲型流感病毒H1N1的LOD（Limitation of Detection，LOD）为3.2×10^-3 HAU（hemagglutinating units，HAU），检测MRSA的LOD为30 CFU（colony-forming units，CFU）	Yu-Dong Ma^［26］
数字流感病毒计数（digital influenza virus counting，DIViC）方法	一种数字流感病毒计数（digital influenza virus counting，DIViC）方法，该方法可以检测无抗体存在的单个病毒颗粒。将病毒随机捕获在飞升反应器阵列装置内孵育几分钟后测定神经氨酸酶的荧光信号。通过分析600 000个反应器，其实际检测限达到了10³（PFU）/mL的水平。系统配备一个基于智能手机的移动成像平台（mobileimaging platform，MobIP），从智能手机获得的图像结果保存为JPEG文件，将图像数据传输到台式计算机后，确定总荧光强度以进行分析。	基于智能手机的移动成像平台MobIP能够对牛碱性磷酸酶和数字流感病毒计数DIViC进行定量数字生物测定。与使用常规荧光显微镜的DIViC相比，使用MobIP进行DIViC的检测效率为60％。但配备MobIP的DIViC的灵敏度仍比商业快速流感诊断测试高100倍	Yoshihiro Minagawa^［41］

表4 发展中的流感POCT生物芯片技术

项目	原理	特点	作者
生物传感器技术	靶DNA通过PCR产生标记有生物素的核酸产物，在传感器中PCR产物与特异性探针结合，该探针被磁珠上共价结合的特异性寡核苷酸捕获，通过链霉亲和素-碱性磷酸酶与PCR产物相结合，碱性磷酸酶可切割底物的磷酸基团产生电流信号，电化学传感器通过检测电流信号对PCR产物进行定量。但该设备缺乏RNA逆转录功能。	检测速度快（16 min），但只能检测DNA	J. A. MacLeod^［34］
生物芯片技术	基于RT-PCR的微流控芯片	以检测多呼吸道病毒，但缺乏自动提取核酸的功能	Hardick^［35］
生物芯片技术	为将逆转录引物共价固定在聚乙二醇水凝胶颗粒表面，并将封闭了PCR引物在内的低熔点琼脂糖凝胶胶囊（low melti-ng point agarose，LMPA）引入至上述颗粒中，在逆转录过程中水凝胶颗粒上的逆转录引物与靶RNA进行逆转录反应，由于逆转录反应温度低于LMPA的熔点不会使PCR引物释放出来，当温度上升至PCR反应温度时PCR引物可从熔融的LMPA中释放并以游离形式参与PCR反应。	大量减少了传统RT-PCR反应时逆转录引物、PCR引物和靶RNA在逆转录时可能产生的非特异性产物。该技术还可以通过使用单色荧光光学系统在30 min内有效的进行18种一步qRT-PCR	Junsun Kim^［36］
生物芯片技术	基于芯片的一步法多重RT-PCR技术，并根据荧光信号判断结果	在23 min内完成反应，但缺乏自动提取核酸的功能	Soon-Hwan Kwon^［37］
生物芯片技术	利用磁性和标记有不同血凝素抗体的体积大小不同的磁珠在磁场中分离流感病毒血凝素，在微流控芯片上建立了可同时检测和分离多重流感血凝素（HA）的免疫自动检测方法	特异性高、抗干扰能力强、重复性好。H7N9 HA的检出浓度低至3.4 ng/ml，H9N2 HA的检出浓度为4.5 ng/ml	Shuibing Wang^［38］
生物芯片技术	利用双适配子设计了一个完整的磁珠微流控系统，样品中存在甲型流感病毒时，可在芯片上形成适配子-H1N1病毒-适配子结合复合物，并通过荧光信号表达	检测时间短（30 min），无需人工干预，检测成本低，灵敏度是常规血清学诊断的10³倍	Yi-Ting Tseng^［39］
生物芯片技术	一种基于芯片的检测系统，名为iROAD，该系统使用基于逆转录的RPA技术，以无标记和实时的方式同时进行病毒RNA的扩增和检测	检测限是实时逆转录-PCR方法的10倍，可用于快速分析（＜20 min），但缺乏自动提取核酸的功能	Bonhan Koo^［40］
生物芯片技术	多重呼吸道病毒检测的LAMP集成微流控芯片系统（LAMP-integrated microfluidic chip system formultiplexed respiratory virus assays，LMCS-MRVA），该系统包括用于核酸提取的磁珠、与LAMP技术结合的八通道微流控阵列芯片，以及实时对结果颜色的变化进行比色分析	该检测系统通过制作相对独立、完全密封的反应室，避免了LAMP反应时的气溶胶污染、试剂蒸发和交叉污染。该系统对咽拭子标本中2~4 fg/μl的检出限在1 h内即可完成，特异性（100%）和灵敏度（96%）高	Wang R^［19］
生物芯片技术	一种使用等温扩增（LAMP）方法的微流控设备。	该系统速度快（＜40 min），体积小（19.3×16.5×12.3 cm³），由锂（Li）离子电池供电，可通过智能手机上的软件控制反应时间、温度，实时监控LAMP反应状态并观察检测结果，可由非专业人员操作且可定性和定量检测病原体。检测甲型流感病毒H1N1的LOD（Limitation of Detection，LOD）为3.2×10^-3 HAU（hemagglutinating units，HAU），检测MRSA的LOD为30 CFU（colony-forming units，CFU）	Yu-Dong Ma^［26］
数字流感病毒计数（digital influenza virus counting，DIViC）方法	一种数字流感病毒计数（digital influenza virus counting，DIViC）方法，该方法可以检测无抗体存在的单个病毒颗粒。将病毒随机捕获在飞升反应器阵列装置内孵育几分钟后测定神经氨酸酶的荧光信号。通过分析600 000个反应器，其实际检测限达到了10³（PFU）/mL的水平。系统配备一个基于智能手机的移动成像平台（mobileimaging platform，MobIP），从智能手机获得的图像结果保存为JPEG文件，将图像数据传输到台式计算机后，确定总荧光强度以进行分析。	基于智能手机的移动成像平台MobIP能够对牛碱性磷酸酶和数字流感病毒计数DIViC进行定量数字生物测定。与使用常规荧光显微镜的DIViC相比，使用MobIP进行DIViC的检测效率为60％。但配备MobIP的DIViC的灵敏度仍比商业快速流感诊断测试高100倍	Yoshihiro Minagawa^［41］

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